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English| 發(fā)布日期：2024-11-08 |
一、研究背景
小麥（Triticum aestivum L.）作為全球重要的谷物之一，在許多深加工食品中扮演著關(guān)鍵角色，為人類提供必需的微量元素和能量。然而，小麥被世界衛(wèi)生組織認(rèn)定為八大致敏原之一，全球約有0.4%的人口受到小麥過(guò)敏引起的超敏反應(yīng)影響，尤其在歐洲這個(gè)比例高達(dá)3.6%。其中麩質(zhì)作為小麥中的主要過(guò)敏原，引起了越來(lái)越多的關(guān)注，鑒于小麥麩質(zhì)過(guò)敏的普遍性和對(duì)公共健康構(gòu)成的威脅，建立一個(gè)準(zhǔn)確可靠、靈敏度高的小麥致敏原檢測(cè)方法尤為重要。本研究旨在開(kāi)發(fā)一種基于銀納米粒子/金屬有機(jī)框架（AgNPs/MOF）基質(zhì)的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）傳感器，并使用如海光電的RMS1000實(shí)現(xiàn)對(duì)小麥谷朊粉的高靈敏度現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，為食品安全領(lǐng)域提供一種快速、可靠的檢測(cè)手段，同時(shí)為過(guò)敏原標(biāo)簽監(jiān)管提供技術(shù)支持。
1. 實(shí)驗(yàn)方法
基于氨基與環(huán)氧基的偶聯(lián)反應(yīng)，修飾了氨基的捕獲DNA（Capture DNA，cDNA）共價(jià)結(jié)合在修飾了環(huán)氧基團(tuán)的石英片上。當(dāng)樣品中存在目標(biāo)DNA（Target DNA，tDNA）時(shí)，tDNA可以通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)作用被其部分互補(bǔ)序列 cDNA 識(shí)別和捕獲。隨后，SERS-探針（SERS-probe）上的探針DNA（Probe DNA，pDNA）會(huì)與tDNA發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，形成“三明治”夾心結(jié)構(gòu)的檢測(cè)體系，此時(shí)檢測(cè)體系SERS信號(hào)增大，SERS-probe反映的SERS強(qiáng)度與tDNA濃度呈正相關(guān)。
圖1 基于S-CNF/Au NSs 2D襯底的MDA檢測(cè)示意圖原理圖
2. AgNPs/MOF 的 SERS 光譜表征
對(duì)不同濃度AgNO3制備的AgNPs/MOF基底的SERS光譜進(jìn)行了表征。4-MBA在1078、1144和1585 cm?1有特征峰。從圖2可以看出，MOF上幾乎無(wú)4-MBA的SERS信號(hào)，而AgNPs和AgNPs/MOF上信號(hào)清晰。且AgNPs/MOF的信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)大于AgNPs，尤其是0.2 M AgNO3制備的。這是因?yàn)锳gNPs/MOF吸附性能更強(qiáng)、熱點(diǎn)更豐富。因此，本研究選0.2 M AgNO3為制備AgNPs/MOF的最佳濃度。
圖2 MOF（a）、AgNPs（b）和不同AgNO3濃度制備的AgNPs/MOF（c-h）的拉曼光譜圖。c-h：AgNO3加入濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 M
3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析
在優(yōu)化條件下，加入不同濃度的小麥特異性DNA片段（tDNA），監(jiān)測(cè)SERS強(qiáng)度。結(jié)果顯示，SERS光譜中1078 cm?1特征峰的強(qiáng)度與tDNA濃度成正比。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，在1×10?1?至2×10?? M范圍內(nèi)，SERS強(qiáng)度與tDNA濃度對(duì)數(shù)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y=745.57 lgX+12475.86，R2=0.9959。該傳感器的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為1.16×10?1? M和1.56×10?1? M，相比電化學(xué)傳感器，LOD更低，靈敏度更高。
圖3 AgNPs/MOF SERS傳感器加入不同濃度 tDNA 的 SERS 譜圖（A）和檢測(cè) tDNA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）
4. 特異性分析
為驗(yàn)證檢測(cè)體系特異性，提取小麥、花生、大豆、堅(jiān)果和魚(yú)的全基因組DNA進(jìn)行SERS檢測(cè)，并設(shè)超純水為陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，空白樣品（花生、大豆、堅(jiān)果和魚(yú)）的SERS強(qiáng)度接近陰性對(duì)照，表明非特異性結(jié)合可忽略。因此，本研究構(gòu)建的AgNPs/MOF SERS傳感器對(duì)小麥麩質(zhì)檢測(cè)具良好特異性（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。
圖4 特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)拉曼圖譜（A）和 AgNPs/MOF SERS 傳感器的特異性分析（B）
5. 精密度分析
分別取濃度為10-9，10-10，10-11 M 的tDNA在不同時(shí)間檢測(cè)三次，根據(jù)同批次內(nèi)和不同批次間的變異系數(shù)（CV%），驗(yàn)證該方法的精密度。結(jié)果如圖5所示，批次內(nèi)的變異系數(shù)為1.80%~3.18%，批次間的變異系數(shù)為1.24%~4.29%，證明檢測(cè)體系的精密度良好。
圖5 SERS 傳感器在不同濃度的tDNA下測(cè)量9次后獲得批內(nèi)精度。（A）10-9 mol/L（B）10-10 mol/L（C）10-11 mol/L
6. 準(zhǔn)確的分析
通過(guò)對(duì)空白樣品的加標(biāo)回收率來(lái)評(píng)估準(zhǔn)確度。在空白樣品（花生、大豆和堅(jiān)果）中添加tDNA使最終樣品中tDNA濃度為0.5、1.0和2.0 μM，并按照上述檢測(cè)方法測(cè)定SERS信號(hào)。 從圖6可以看出，樣品回收率在96.34%~104.44%之間，符合方法學(xué)回收率的要求，證明該方法的準(zhǔn)確度良好。
圖6 AgNPs/MOF SERS 傳感器檢測(cè)其他致敏原樣品中添加的標(biāo)準(zhǔn)tDNA的SERS光譜（A），空白樣品加標(biāo)回收分析（B）
7. 時(shí)間穩(wěn)定性
AgNPs/MOF SERS傳感器在4℃儲(chǔ)存條件下的穩(wěn)定性結(jié)果如圖7所示，在15天內(nèi)其對(duì)小麥麩質(zhì)的檢測(cè)信號(hào)仍然保持在初始檢測(cè)值的 91.97%，表明此檢測(cè)體系具有良好的時(shí)間穩(wěn)定性。
圖7 不同儲(chǔ)存時(shí)間的 AgNPs/MOF SERS傳感器檢測(cè)tDNA的SERS光譜（A）和 AgNPs/MOFSERS傳感器在4℃的時(shí)間穩(wěn)定性分析（B）
使用如海光電的RMS1000拉曼光譜儀證明了一種基于AgNPs/MOF底物的新型SERS傳感器，可用于高靈敏度現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)深加工食品中的小麥面筋。設(shè)計(jì)的SERS傳感器對(duì)小麥谷朊粉表現(xiàn)出了1×10-15至2×10-6 mol/L的線性檢測(cè)范圍，并且檢出限為1.16×10-16 mol/L（信噪比=3），顯示出卓越的靈敏度。說(shuō)明這種SERS傳感器是準(zhǔn)確、高靈敏度和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)深度加工產(chǎn)品中小麥谷朊粉的有效和適用策略。預(yù)計(jì)這種SERS傳感器將被廣泛應(yīng)用于食品安全控制，并為過(guò)敏原標(biāo)簽監(jiān)管提供技術(shù)支持。
文中使用產(chǎn)品RMS1000現(xiàn)已升級(jí)為RMS3000。
RMS3000微型拉曼光譜儀
1. 產(chǎn)品簡(jiǎn)介
RMS3000（Raman Minimal System）是一款微型的785 nm同軸共聚焦拉曼光譜儀，其采用全空間光設(shè)計(jì)，優(yōu)化散熱接口，采用N.A0.11數(shù)值孔徑激發(fā)采集光路。支持Windows、Linux和Windows多種操作平臺(tái)和主控系統(tǒng)，隨機(jī)配備手機(jī)端（Andorid）和電腦端采集分析軟件。具備非凡的分辨率、靈敏度、穿透能力和抑制熒光干擾能力。既可以單獨(dú)使用也可以作為核心部件集成進(jìn)拉曼自動(dòng)化系統(tǒng)，滿足科研院所、相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)與企業(yè)在無(wú)機(jī)/有機(jī)材料、生物生命、化學(xué)/化工、藥物分析、食品安全、刑偵鑒定、環(huán)境污染檢測(cè)等研究中的需求。
2. 產(chǎn)品特點(diǎn)
?體積小巧，重量輕，只有103×83×26 mm和305 g；
?空間光、微型共聚焦設(shè)計(jì)，最小光斑≤30 μm；
?高分辨率（~6 cm-1），高抑制熒光能力，能夠輕松測(cè)量高熒光樣品，獲取拉曼光譜；
?高靈敏度，500 ms即可實(shí)現(xiàn)常規(guī)化學(xué)品的拉曼光譜，最低可以檢測(cè)0.3%的分析純酒精；
?可配置線掃式探頭，可以采集4.5 mm*1 mm的線掃光斑，降低樣品照射功率密度；
?可配置外觸發(fā)手柄，方便工業(yè)現(xiàn)場(chǎng)數(shù)據(jù)采集；
?支持手機(jī)和電腦雙平臺(tái)，方便戶外現(xiàn)場(chǎng)直接測(cè)量；
?超低功耗，無(wú)須額外電源供電，通過(guò)USB手機(jī)可以直接實(shí)現(xiàn)光譜采集分析；
?強(qiáng)大的軟件分析功能，支持常規(guī)的HQI，峰位檢索，深度學(xué)習(xí)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等算法；
?可以適配顯微鏡組成顯微共聚焦拉曼。
