| 發布日期：2022-06-02 |
前言：
熒光是一種光致發光現象，涉及到光的吸收和發射兩種過程，可比其他光譜方法獲得更多的信息。16世紀西班牙的內科醫生和植物學家N.Monardes首次記錄到熒光現象，1575年他提到在含有一種稱為“LignumNephriticum”的木頭切片的水溶液中呈現出了天藍色。在17世紀，Boyle和Newton等著名科學家再次觀察到熒光現象。之后熒光就引起了許多科學家的研究興趣，熒光分析方法也越來越多的被應用到生物和化學分析當中。
由于激發的熒光強度一定條件下正比于激發源的強度，為了能夠獲得更強的熒光信號，此后的研究工作在很大程度上是致力于尋找合適的激發光源，其性能指標除了高強度這一最主要的因素之外，還需包括穩定性、長壽命、廉價和操作上的靈活性等特點，而激光光源則滿足了上述的性能要求。
激光作為熒光光譜的激發源最初是由美國維恩福納特、摩姆斯特塔和庫爾等人幾乎同時開始研究的，隨著激光技術的發展，各種類型的激光器相繼應用于熒光光譜研究，其中較為常見的是用Ar--+激光器、氮分子激光器、Nd:YAG激光器、準分子激光器作為泵浦源，以可調諧染料激光器作為激發源進行熒光研究。與常規激發光源相比，可調諧染料激光器用于熒光光譜研究具有很大的優越性，雖然目前的染料激光器的調諧范圍多在可見光波段，但經過倍頻可將波長范圍擴展到接近真空紫外波段，適用于絕大多數熒光物質的激發波長，同時染料激光器具有很高的激發強度，可以提供高達數十兆瓦的峰值功率。激光束具有很好的空間和時間相干性，在較小的光斑中有很高的功率和很窄的線寬，具有很低的占空因子，有利于提高信噪比，因而可以獲得較低的檢出限和較高的光譜選擇性。
目前激光誘導熒光光譜分析法已經成為一種重要且有效的光譜化學分析手段。在我國，50年代初期僅有少數的分析化學工作者從事激光誘導熒光分析方面的研究工作，但到了70年代后期，該分析法已引起國內分析屆的廣泛重視，激光誘導熒光光譜法近些年來在生物醫學、食品、藥物分析、環境分析等領域發揮了重要作用。
讓一束激光通過檢測區域，調節激光波長，當激光光子的能量（與激光的波長相關）等于檢測區域某種組分分子的某兩個特定能級之間的能量之差時，該分子會吸收光子能量躍遷至高能態。處于高能態的分子不穩定，在一定時間內它會從高能態返回到基態。在此過程中，分子會通過自發輻射釋放能量發光而產生熒光，這就是激光誘導熒光產生的原理。
由熒光的發光原理可知，分子熒光光譜與激發光源的波長無關，只與熒光物質本身的能級結構有關，所以可以根據熒光譜線對熒光物質進行定性分析鑒別。照射光越強，被激發到激發態的分子數越多，因而產生的熒光強度越強，測量時靈敏度越高。一般由激光誘導熒光測量物質的特性比由一般光源誘導熒光所測靈敏度高2-10倍。
在實際應用中，通過激光誘導產生的熒光峰位的分布，可以探測粒子的種類；從熒光的強弱，可得知粒子的濃度以及溫度；利用其空間分辨性還可以測量粒子的濃度場、溫度場等信息。
激光誘導熒光光譜儀主要由光源、檢測池和光纖光譜儀組成。
激光器：激光器是激光誘導熒光光譜儀的重要組成部分，用半導體激光器為光源，采用時間分辨技術可消除瑞利散射光（半徑比光或其他電磁輻射的波長）對測定的干擾，同時增加被檢測成分之間測定的選擇性。激光器具有方向性、單色性好、參數可以精確控制、相干性好、強度大等特性。以上這些特性使激光誘導熒光檢測器的信噪比大大增強，顯示出較高的靈敏度和較好的選擇性。
光纖光譜儀：激光誘導熒光光譜的光學系統元件主要有光學透鏡、光柵和電耦合器件（CCD）。透鏡在光譜儀中的主要作用是對入射光線的準直以及經過單色后的聚焦。激光在光譜儀中作為光源時，用光柵分光能得到較高的信噪比，但其透光效率低，如f/4光柵大約僅能透過入射光強度的0.3%。由于激光本身有很好的單色性，因此光譜儀中很少采用帶通濾光片，采用較多的是剪切式濾光片和空間濾光片。作為熒光信號接收器——電荷耦合器件具有較高的量子效率和信噪比，增強型的甚至可以進行單分子檢測。通過加和和合并，電荷耦合器件還可以進一步提高信噪比。
檢測池：常規熒光檢測池采用立方形的較多。激光垂直入射到檢測池上，再從側面接收其熒光信號，這樣可以消除由于激光散射及反射產生的背景噪聲，提高檢測靈敏度。
由于激光誘導熒光光譜能夠提供發射光譜、熒光峰的位置、峰值強度、量子產率、熒光壽命等豐富的熒光信息，使得激光誘導熒光光譜技術已被應用于工業過程檢測、藥品化妝品分析檢測、食品安全、生命科學、刑偵等多個領域，特別是在需要進行無損檢測、化學分析、成像分析時，激光誘導熒光分析都能夠快速提供重要信息。
在生物學領域激光誘導熒光光譜法可用于葉綠素熒光壽命的測量：采用波長為355nm的激光作為光源激發葉綠素熒光，該方法可以實現對葉綠素熒光壽命的高精度實時監測，證明葉綠素含量與其熒光壽命具有相關性，進一步確定葉綠素含量與熒光壽命的標定曲線。
激光誘導熒光光譜也可用于環保領域中水質的監測，例如激光誘導熒光遙測系統以355nm激發波長的激光器為激發光源。脈沖激光通過卡塞格倫望遠鏡射入待測水體，散射的熒光進入望遠鏡，對測得的瑞利散射光以水的拉曼光強度進行歸一化，即可得到瑞利散射因子，其與水體渾濁度成線性正相關。
在化學反應過程，例如燃燒系統中，激光誘導熒光光譜分析法可以測量溫度、粒子濃度等。激光誘導熒光光譜法在火焰中對粒子濃度的測量包括：瞬態自由基粒子的測量，瞬態自由基是燃燒中的反應中間體，如OH等；還可以測量反應中的污染粒子，用于對污染物的控制與排放，常見的污染粒子有NO、CO、NO2、SO2等分子，激光誘導熒光光譜法的空間與時間的分辨測量有助于深入理解燃燒過程中這些粒子形成的機理，同時還可以用來測量Na、K、NaS等。
維生素B2屬于水溶性維生素，是人體中許多重要酶的組成成分，是人體不可或缺的幾種維生素之一。維生素B2能夠促進發育和細胞再生，促使皮膚、指甲、毛發的正常生長，幫助消除口腔、唇、舌的炎癥，增進視力，減輕眼睛疲勞，幫助碳水化合物、脂肪、蛋白質的代謝。維生素B2通常以結合態或游離態存在于糧食、蔬菜、果品及動植物體內。純品也作為嬰幼兒食品、強化食品及飲料的營養添加劑，對于微量維生素B2含量的定量檢測是食品藥品檢驗中不可或缺的一環。
近年來對于維生素B2的含量測定研究主要有高效液相色譜法和熒光法。相較于高效液相色譜法，熒光分析法具有取樣少，方法快速，選擇性強，靈敏度高等特點。目前主要被應用于醫學檢驗、生物醫學、藥物、環境監測、食品分析等領域，其對體內活性物質及藥物代謝物的測定更為重要。維生素B2在藍光照射下會發生綠色熒光，因此檢驗食品中維生素B2可先經過預處理，使維生素B2溶于水中，再使用熒光分析法對其定性及定量測定。
1、熒光分析的定量依據：
熒光是物質在吸收光能之后所發生的輻射，樣品溶液的熒光強度與樣品的吸收系數、量子效率和濃度有關。樣品稀溶液的熒光強度F表達式為：F=KΦln(I0/I0-IA)=KΦI0εbc
Φ 其中是熒光物質的量子效率，I0是激發光的強度，IA為熒光物質吸收光的強度，ε是該物質的摩爾吸光系數，b為吸收光程，c為物質濃度，K是與收集效率、傳輸效率等因素相關的常數。在給定的熒光物質濃度較低的情況下，熒光強度與熒光物質的濃度成正比，這就是熒光檢測的定量基礎。
2.影響熒光特性的因素：
物質熒光的特性首先取決于其自身的能量狀態，即取決于其分子結構，其次還受到外界因素，如溫度、溶劑、酸度等的影響。
MS11639光纖光譜儀 | |
激光器 | 405nm穩譜激光器 |
軟件 | UspectralPlus軟件 |
光纖 | QP600-2-VIS-NIR-SS近紅外石英光纖、405nm拉曼激光探頭 |
采樣附件 | 四通液體測量池、比色皿、固體采樣支架 |
MS11639光纖光譜儀：
MS11639是一款光譜范圍為200nm-1100nm的光纖光譜儀。檢測器采用濱松COMS探測器， 16-bit A/D采樣和75%的量子效率為光譜儀提供高信噪比和大的動態范圍。 該光譜儀在UV-VIS-NIS具有良好的響應性能。相對常見產品， 采用雙閃耀光柵，優化了UV 和NIR波段的光譜響應，且提升了光譜儀靈敏度20%效率，并有效降低了50%的雜散光。配置雙閃耀光柵的MS11639光譜儀，有效平衡全譜段響應，可以廣泛應用在理化分析、生物樣品、半導體材料檢測，光學檢測和材料檢測等領域。
相比于傳統CCD探測器，CMOS探測器的應用，在紫外波段具有更好的響應。利用紫外差分吸收光譜技術，非常適合一氧化氮、二氧化硫的檢測。MS11639在0-40℃，光譜波長偏移< 0.1nm，具備良好熱穩定性，能夠應用于定性、定量檢測場景。
項目 | 值 |
尺寸 | 126mm×91.5mm×40mm |
重量 | ~420g |
探測器 | Hamamatsu 11639 |
波長范圍 | 200-1100nm |
光柵 | 雙閃耀光柵 |
消除高階衍射 | 可選3種前置、4種后置濾光片，以消除光譜中的鬼線 |
光學平臺 | M型對稱非交叉 C-T式光路 |
狹縫 | 100um |
焦距 | 98mm |
像素 | 2048 pixels |
光學分辨率（FWHM） | <2.6nm |
信噪比 | 400:1 |
動態范圍 | 3000:1 |
積分時間 | 4ms-65 second |
連接器 | Micro USB |
運行環境 | Windows XP，Win7，Win8，Win10 |
適配軟件 | Uspectral Plus（支持數據自動保存） |
405nm穩譜激光器：
科研版穩光譜激光器主要面向科研用戶，需要自行搭建光譜或者光學測量系統用途。該激光器外置了功率調節、功率顯示、安全開關， 方便客戶使用和觀察。內置TEC制冷以及風冷兩級制冷， 確保激光器能夠實現穩光譜和穩功率。該產品非常適用于拉曼光譜、醫療儀器、傳感以及其他測量等領域的應用。
項目 | 值 |
尺寸 | 300x200x62mm |
重量 | 1.2Kg |
輸出接口 | FC/SMA905 |
峰值波長 | 405±0.5nm |
激光線寬 | ＜2.0nm |
激光功率 | 0~80mW可調 |
功率穩定性 | ＜3%P-P（2hrs） |
壽命 | 5000hrs |
預熱時間 | 15min |
電源電壓 | 5V/4A，12V/2A |
工作溫度 | 0～45℃ |
工作濕度 | 5～80% |
1.樣品制備：
（1）將兩片維生素B2藥片（維生素B2含量共10mg）研磨粉碎，將其置入100ml容量瓶中并加入去離子水至刻度處，配制出濃度為100mg/L的標準溶液。
（2）取出六個刻度為50ml的容量瓶，分別向其中加入0.5、1、2、3、4、5ml的100mg/L的標準溶液，再加入等離子水至刻度處。從而獲得濃度為1、2、4、6、8、10mg/L的標準溶液。
2.儀器連接：
連接儀器如圖1所示：405nm激光探頭的光源端連接在405nm激光器上，并將探頭固定在測量支架上，將四通液體測量池放置于載物臺上使得激光恰好能夠照射入比色皿中，再用近紅外光纖將四通液體測量池與光譜儀相連，并用USB數據線將光譜儀連接到電腦上。
圖1.激光誘導熒光實驗搭建
3.光譜采集：
（1）將維生素B2溶液樣品用移液槍取出置于石英比色皿中，并將比色皿放置于四通液體測量池中。
（2）將405nm激光器探頭固定在固體測量支架上，再將四通液體測量池放置于激光探頭之下，調節探頭高度使得激光焦點位于液面之下。
（3）打開激光器，使得激光從液體正上方射入，光纖從液體測量池側方接收熒光信號。
（4）打開電腦上的光譜采集分析軟件，點擊“單次”進行測量得到樣品熒光強度隨波長變化譜圖。
（5）更換樣品，重復上述測量步驟。
4. 未知濃度樣品的測定：
記錄樣品熒光光譜波峰處的波長與峰高信息，并繪制在該特定峰位樣品的熒光強度-濃度曲線，經線性擬合后得到樣品的線性回歸方程，通過線性回歸方程計算未知樣品的濃度。
實驗測得六個標準濃度的樣品及未知濃度樣品的激光誘導熒光光譜如圖2所示：
圖2. 不同濃度維生素B2熒光光譜
結果顯示維生素B2的熒光光譜特征峰位于530nm處，記錄530nm處每個樣品的特征峰強度表如下：
濃度(mg/L) | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 未知濃度 |
特征峰強 | 997.7 | 4342.8 | 11913.3 | 19144.3 | 29141.7 | 35487.6 | 1850.4 |
繪制出在530nm處的熒光強度與濃度的關系圖并對其進行線性擬合，得到圖2：
圖3. 維生素B2發光強度與濃度線性擬合曲線
由圖3得知在1-10mg/L濃度范圍內，維生素B2熒光強度與其濃度成線性關系，且相關度較高，線性擬合吸收系數為0.9969，線性擬合方程為：y = 78324x - 3395.9。將未知濃度樣品在530nm特征峰的強度信息代入方程中可得到其濃度為：0.067mg/L。
通過實驗測得了維生素B2在405nm波長的激光器激發下的熒光光譜，通過配制不同濃度梯度的標準溶液得到了維生素B2在一定濃度范圍內的發光強度與濃度的關系曲線，通過發光強度與濃度的線性擬合方程計算得出未知樣品的維生素B2濃度為0.067mg/L。
